Вирусный гепатит с лабораторная диагностика

Лабораторная диагностика вирусного гепатита С

особое положение вирусного гепатита С среди других гепатитов обусловлено катастрофическим ростом инфицированности вирусом гепатита С населения и особенно молодежи, что связывают с ростом шприцевой наркомании.

ВВЕДЕНИЕ

Вирус гепатита С или HCV (Hepatitis C Virus) относится к семейству флавовирусов. Геном вируса представлен однонитчатой позитивной РНК, состоящих из 10 000 нуклеотидных оснований, образующих регионы, которые кодируют три структурных белка (С, Е1, Е2) и пять неструктурных (NS2, NS3, NS4, NS5). Особенностью HCV является чрезвычайно высокая гетерогенность его генома. Анализ нуклеиновых кислот РНК HCV различных изолятов выявил существенные отличия в их первичной структуре. На основании этих данных была построена классификация HCV, разделяющая его на варианты и субтипы-генотипы, одни из которых присутствуют во всех регионах мира, а другие только в отдельных странах.

Учитывая, что при HCV вирус находится в крайне низкой концентрации и его антигены не доступны выявлению с помощью современных методов индикации, усилия исследователей сосредоточены на выявлении антител к различным антигенным компонентам вируса, обнаружение которых может служить индикатором наличия вируса. В качестве антигенов использовали белки, кодированные структурной и неструктурной зоной РНК-HCV, полученные при помощи рекомбинантной технологиии или синтеза (полипептиды, используемые в современных иммунологических методах – С22-3; С33с, С100-3, С200, NS5, S-1-1). Таким образом, лабораторная диагностика HCV основывается на обнаружении серологических маркерв HCV: антител к HCV (анти- HCV, анти- HCV класса IgМ, IgG) методом ИФА и РНК- HCV методом ПЦР.

СКРИНИНГОВАЯ ДИАГНОСТИКА

С целью скрининговой диагностики HCV применяют определение так называемых общих антител к HCV (Anti-HCV), поскольку положительных результатов данного исследования ограничена — наличие общих антител к HCV позволяет лишь констатировать факт контакта пациента с вирусом гепатита С и не позволяет судить о давности процесса, а также о его прогрессировании или о завершенности (не может служить показателем выздоровления больного). Также не отмечается и корреляции с выраженностью клинического течения HCV-инфекции. Таким образом, обнаружение только общих антител к HCV дает основание для дальнейшего комплексного, в том числе специфического лабораторного обследования. ( ! ) Общие антитела к вирусу гепатита С сохраняются в организме неограниченное время.

При положительном результате обследования пациента на антитела к HCV и отсутствии клинической картины гепатита необходимо направить пациента к инфекционисту. Для получения более полной характеристики следует провести дополнительное обследование: (1) биохимическое исследование крови (т. н. печеночные пробы — АЛТ, АСТ, ГГТП (g-глутамилтранспептидаза), холестерин, билирубин и т. д.); (2) раздельное определение антител к HCV; (3) исследование крови на РНК вируса (ПЦР) и при его обнаружении: определение генотипа и титра; (4) желательно также ультразвуковое исследование органов брюшной полости.

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

Специфическая лабораторная диагностика HCV-инфекции основана на: (1) обнаружении специфических антител к основным антигенам вируса и (2) определении РНК вируса, его количества и генотипа.

ОБНАРУЖЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К ОСНОВНЫМ АНТИГЕНАМ ВИРУСА

Антитела класса IgG к вирусу гепатита С (анти-HCV IgG) свидетельствуют о возможной инфицированности HCV или перенесенной инфекции (определяются в скрининговых исследованиях). В свою очередь антитела класса IgG к ядерным белкам HCV (анти-HCV core IgG) свидетельствуют об инфицированности HCV или перенесенной инфекции.

Антитела класса IgM к HCV, определяемые иммуноферментным методом, позволяют говорить не только об инфицировании HCV, но с определенной долей достоверности об острой фазе инфекции или обострении хронического гепатита, несмотря на отсутствие симптомов болезни и гиперферментемии АЛТ, АСТ.

Следует отметить, что к настоящему времени разработаны четыре поколения тест-систем для выявления анти- HCV в иммуноферментном методе, но ИФА первого поколения сейчас не используется из-за низкой чувствительности. Иммуноферментные тест-системы третьего поколения для определения антител к HCV, где в качестве связывающего антигена на твердой фазе используются иммунореактивные синтетические пептиды, являются достаточно чувствительными и информативными, а их широкое использование повысило процент выявления лиц, инфицированных HCV.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РНК ВИРУСА

Вирусная РНК выявляется в цитоплазме большинства гепатоцитов печени уже на первой-второй неделе заражения. В последующем количество вирусных частиц периодически может увеличиваться, но это не всегда коррелирует с наличием РНК в сыворотке крови или со степенью воспалительных изменений в печени. Максимально виремия наблюдается в начале острого периода болезни. Антитела появляются спустя 6–12 недель от начала развития гепатита. Прежде всего выявляются антитела к структурным (связанным с ядерным белком) протеинам, а затем — к неструктурным белкам — NS3, NS4 и NS5 регионов геномa.

Определение рибонуклеиновой кислоты HCV (или HCV-RNA) проводится с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции), которая позволяет с высокой степенью точности показать присутствие или отсутствие вирусной РНК в крови. Метод ПЦР позволяет определить вирусный генотип и его подтип, а также количество РНК (титр или количество генокопий в мл).

Определение генотипа HCV и его титра (т.н. полуколичественное исследование) в крови пациента используется как для диагностики HCV-инфекции, так и для дополнительной оценки активности вирусного процесса и для контроля эффективности комплексного, в том числе противовирусного лечения. Интерпретация полученных результатов ПЦР оценивается следующим образом: 1 + (1:1) и 2 + (1:10) — вирусная РНК определяется в низком титре, уровень виремии низкий, 3 + (1:100) — средний уровень виремии и наконец 4 + (1:1000) и 5 + (1:10000) — высокий уровень виремии.

Следует указать на то, что недостатком этого метода является его ( ! ) технологическая сложность и достаточно высокие в настоящее время экономические затраты, что не позволяет широко внедрить его в массовое лабораторное обследование.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты такого обследования в совокупности с данными эпиданамнеза и физикального обследования на первом этапе помогут выработать правильную тактику лечения и ведения конкретного пациента. Нередко встречаются ситуации, когда результаты комплексного обследования не выявляют никаких отклонений, кроме обнаружения антител к HCV. В этих случаях правомочно говорить о перенесенной ранее субклинической форме HCV-инфекции. Однако, учитывая существующую вероятность реактивации (репликации) вируса, следует поставить больного на диспансерный учет и 2–4 раза в год проводить выборочное лабораторное обследование. Подобные рекомендации даются и пациенту, перенесшему манифестную форму HCV.

Как проводится диагностика гепатитов разных типов

Своевременная сдача анализа на гепатит позволяет оперативно диагностировать болезнь и подобрать необходимую терапию.

Анализ Anti-HAV-IgG позволяет выявить гепатит А, который зачастую передается с грязной водой, зараженными продуктами питания и при прямом контакте с носителем.

Анализ на количественное определение антигена HBsAg необходим для диагностики острого и хронического гепатита В, а также для наблюдения за состоянием пациентов, страдающих этим заболеванием.

Гепатит С — опасное заболевание, передающееся через кровь. Симптомы на первоначальном этапе развития болезни схожи с признаками гриппа. Не пренебрегайте периодической проверкой организма на наличие вируса.

Исследование антител класса IgM к антигенам гепатита D позволяет отличить острую инфекцию от хронической, а также подтвердить факт наличия вируса группы B.

Для того чтобы результаты анализов были максимально достоверными, необходимо правильно подготовиться к их сдаче.

Сдать все необходимые анализы можно не выходя из дома.

Спецпредложения, скидки и акции помогут существенно сэкономить на медицинском обследовании.

Контроль качества лабораторных исследований, осуществляемый по международным стандартам, — дополнительная гарантия точности результатов анализов.

Словом «гепатит» называют целый ряд воспалительных заболеваний печени. Далеко не всегда это заболевание вызывается вирусами, хотя вирусный гепатит — один из самых распространенных. Привести к развитию заболевания могут и другие причины. Как проявляется болезнь, какие меры нужны для точной диагностики гепатита и насколько современные диагностические методы точны?

Особенности диагностики гепатита

Чем бы ни был вызван гепатит, разрушения, произведенные им, практически всегда одинаковы — клетки печени перестают выполнять свои функции и гибнут.

Вирусные гепатиты

Самая распространенная группа гепатитов. Разрушения в клетках печени происходят из-за проникновения в организм специфических вирусов. Различают несколько форм вирусного гепатита — A, B, C, D, E и G.

А, В, D и Е проявляются относительно одинаково — диарея, тошнота и рвота, нарастающая слабость, боль в области желудка и правого подреберья, пожелтение кожных покровов и белков глаз, увеличение печени в размерах. Гепатиты С и G более коварны и нередко долгие годы единственным симптомом является непреходящая усталость.

Лабораторные методы диагностики являются основными при выявлении заболевания. Обязателен ПЦР-анализ на выявление фрагментов РНК вируса и иммунологическое исследование, определяющее наличие антител к вирусу. Также необходимо сделать биохимический анализ крови, определить уровень билирубина и ферментов (например, АлТ, АсТ).

Токсические гепатиты

Не только вирусы, но и токсины растительного и искусственного происхождения могут вызвать гепатит. Различные отравляющие вещества, яды, которые содержатся в растениях и грибах, способствуют гибели клеток печени. Диагностика гепатита этого типа проводится путем выявления уровня билирубина, альбумина и протромбина, а также ферментов.

Лучевой гепатит

Одним из проявлений лучевой болезни, которая возникает из-за радиационного воздействия, является лучевой гепатит. В клинической практике данное заболевание встречается редко. Чтобы возник риск развития этой болезни, человек должен достаточно долго (в течение 3-4 месяцев) получать дозы радиации, превышающие 400 рад. Главный лабораторный метод диагностики лучевого гепатита — биохимический анализ крови и анализ на билирубин.

Аутоиммунный гепатит

Это редкая форма гепатита, и наука до сих пор не может объяснить, почему такое заболевание возникает. При аутоиммунном гепатите защитная система дает сбой и начинает атаковать клетки печени так, словно это чужеродные организмы. Данная форма гепатита часто сопровождает другие аутоиммунные заболевания, но может развиваться и самостоятельно. Для лабораторной диагностики аутоиммунного гепатита исследуется уровень гамма-глобулинов и IgG (болезнь можно заподозрить, если их показатели выше нормальных вдвое и больше), АсТ, АлТ.

Методы лабораторной диагностики вирусных гепатитов

Поскольку вирусные гепатиты распространены шире всего, остановимся на лабораторных методах их диагностики подробнее. Следует сказать, что именно анализ крови может дать больше всего информации об этом заболевании. Инструментальные методы (КТ, МРТ, УЗИ) для диагностики гепатита малоэффективны, они могут дать информацию о состоянии и структуре печени, но не о том, какой именно вирус поразил организм и как давно это произошло.

  • Общий и биохимический анализ крови. Для этого типа гепатита характерны низкий уровень лейкоцитов и высокая скорость оседания эритроцитов (СОЭ), пониженный альбумин и билирубин.
  • Выявление антител к вирусу. Антитела к вирусу гепатита А Анти-НАV IgM можно обнаружить в самом начале заболевания, при появлении первых симптомов, сразу после окончания инкубационного периода. Самый надежный метод диагностики — ПЦР-анализ, позволяющий побнаружить в сыворотке крови антитела даже тогда, когда их концентрация ничтожно мала. Более того, метод ПЦР дает информацию о том, когда именно произошло заражение.
  • Анализ на определение РНК вируса. ПЦР-анализ дает возможность обнаружить и фрагменты РНК вируса гепатита А.
  • Общий и биохимический анализ крови. Как и при гепатите А, этот анализ позволяет оценить изменения в работе и состоянии печени.
  • Анализ на антигены. HBsAg — самый ранний маркер этого вируса, его можно обнаружить уже в инкубационном периоде. Количественное определение этого антигена используют не только для подтверждения диагноза, но и для определения стадии — острой или хронической.
  • Анализ на антитела к антигенам вируса. Наличие антител к HB-core Ag может говорить о том, что человек когда-то переболел гепатитом В, поскольку эти антитела сохраняются в крови еще очень долго после выздоровления, иногда — всю жизнь.
  • Общий и биохимический анализ крови.
  • Анализ на антитела. При проведении выявляется наличие антител IgM.
  • Анализ на определение РНК вируса. Проводится методом ПЦР, позволяет выявить болезнь на ранней стадии и избежать ее перехода в хроническую форму.
  • Определение интерлейкина 28 бета. Анализ, проводится методом ПЦР, позволяет спрогнозировать возможную эффективность лечения.
Ознакомьтесь так же:  Знакомства с девушками вич

Гепатиты D и G

  • Общий и биохимический анализ крови.
  • Определение антител к антигенам. В момент, когда заболевание находится в острой стадии, анализ показывает высокое содержание антител IgM. После этого в течение какого-то времени могут быть обнаружены другие антитела — IgG.
  • Определение РНК вируса. При помощи ПЦР-метода РНК вируса можно обнаружить даже при его малой концентрации. Анализ дает информацию не только о типе вируса, но и о стадии болезни.
  • Общий и биохимический анализ крови.
  • Анализ на определение антител. Это основной лабораторный метод диагностики гепатита Е. Он показывает наличие антител IgM и IgG.

Лабораторные исследования — крайне важная часть диагностики гепатита, и если у вас есть подозрение на это заболевание, необходимо срочно сдать анализы. От их результатов зависит схема и эффективность лечения гепатита.

Как врач определяет оптимальный тип анализа на выявление вируса гепатита?

«Пациенту вообще не нужно думать, какие анализы включает в себя диагностика вирусных гепатитов и какой метод исследования выбрать. Это определит врач, — говорит эксперт лаборатории «Инвитро». — Диагностика гепатита — отработанная схема. Сначала врачу нужно выяснить состояние печени, выявить изменения в ее функционировании, определить степень поражения. Для этого проводится биохимический анализ крови — по уровню ферментов, липидов, соотношению белковых фракций специалист может определить, какие именно процессы происходят в печени. Общий анализ крови дает информацию о воспалительных процессах и позволяет подтвердить наличие инфекции, хотя и не может сказать, с каким именно возбудителем мы имеем дело. На этот вопрос отвечают другие анализы — иммунологические исследования на определение антител и анализы, выявляющие наличие РНК/ДНК вируса. Выделив РНК/ДНК, врач точно может сказать, какой тип гепатита поразил печень, как давно это произошло и в какой стадии находится заболевание. Получив данную информацию, можно приступать к лечению. Именно поэтому своевременное и качественное проведение лабораторных анализов так важно — любая ошибка на каждом этапе может привести к тому, что специалист получит неверные данные и выбранная на их основе терапия окажется неэффективной. Я настоятельно рекомендую отнестись к выбору лаборатории для проведения исследований серьезно. Обратите внимание на такие моменты, как наличие собственного исследовательского комплекса, система контроля качества, квалификация сотрудников и выбор анализов. Большое количество проводимых исследований говорит о высоком уровне лаборатории — это значит, что вы имеете дело с крупным учреждением, которое может позволить себе дорогостоящее современное оборудование и материалы.

P.S. «ИНВИТРО» — крупнейшая частная сеть лабораторий страны, проводит более 1000 видов исследований. Ежедневно ее пациентами становятся 24 000 человек. Результаты анализов признаются всеми медицинскими учреждениями России.

Лицензия на осуществление медицинской деятельности ЛО-50-01-008046, 13.09.2016 г.

Лабораторная диагностика вирусных гепатитов В и С

Результаты проведенных лабораторных исследований играют существенную, если не ведущую, роль для подтверждения диагноза вирусного гепатита и установления его этиологии.

Биохимический анализ крови

Биохимический анализ крови пациентов давно вошел в практику клинических лабораторий. Совокупность получаемых данных о показателях обмена биллирубина, сывороточных белках и ферментах позволяют обнаружить воспалительные процессы, происходящие в организме человека и предположить их локализацию. Эти критерии не специфичны и не характеризуют этиологию вирусных гепатитов, вместе с тем существенны для оценки функционального состояния печени.

Показатели обмена билирубина.

Оценить у пациента состояние обмена билирубина можно на основании биохимического анализа крови, мочи и кала. Свободный билирубин является производной гемоглобина, высвобождающегося в процессе гемолиза эритроцитов. В физиологических условиях каждые сутки гемолизируется примерно 1% циркулирующих эритроцитов, из которых образуется 200-250 мг билирубина. Основная часть билирубина поступает в кровяное русло из клеток системы мононуклеарных фагоцитов селезенки и костного мозга. Билирубин нерастворим в воде, поэтому в крови его перенос осуществляют неспецифические транспортные белки — альбумины. Свободный билирубин является токсичным соединением, способным проникать через гемато-энцефалический барьер, вызывая энцефалопатии. Детоксикация билирубина происходит в клетках печени, где к нему присоединяется глюкуроновая кислота, образуя глюкурониды билирубина. Эти соединения уже не токсичны и водорастворимы, что облегчает их выведение из организма в составе желчи. В кишечнике под действием бактериальных ферментов образуются две группы продуктов распада билирубина — уробилиногены и стеркобилиногены, основная часть которых выводится с калом. В нормальных физиологических условиях почки в выведении билирубина не участвуют.
Билирубин в крови здорового человека содержится в концентрации 1,7 — 17,1 мкмоль/л и представлен двумя фракциями: нерастворимый билирубин, связанный с альбумином — непрямой билирубин, и растворимые глюкорониды билирубина — прямой билирубин. В норме их соотношение составляет 3 : 1.
При гепатитах повреждаются клетки печени и, вследствие этого, снижается продукция желчи. Кроме того, в результате повреждения паренхимы печени желчь поступает не только в желчные канальцы, но и в кровь. Эти процессы приводят к увеличению общего билирубина крови за счет обоих его фракций. Отмечено, что уже в конце преджелтушного периода у части больных на фоне нормального общего билирубина начинает расти фракция прямого билирубина, что является ранним показателем цитолитических процессов в печени. В моче начинают выявляться билирубин и уробилины, а концентрация стеркобилина в кале резко снижается (таблица 1).
Таблица 1. Соотношение показателей обмена билирубина в норме и при развитии печеночной желтухи.

Общий билирубин сыворотки крови

1,7 — 17,1 мкмоль/л

Прямой билирубин сыворотки крови

Непрямой билирубин сыворотки крови

Реакция мочи на билирубин и уробилин

Реакция кала на стеркобилин

Следует отметить, что показатели обмена билирубина для диагностики вирусного гепатита играют роль только при развитии желтухи. Безжелтушная форма и преджелтушная фаза вирусных гепатитов в своем большинстве остаются нераспознанными.

Оценка активности ферментов.

Определение активности аминотрансфераз сыворотки (аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ)) является высокочувствительным показателем цитолиза гепатоцитов, что определяет ее ведущую роль в диагностике гепатитов различной этиологии. При цитолитическом процессе, развивающимся в печени больного вирусным гепатитом, преобладает «вымывание» АЛТ, степень повышения АСТ существенно меньше (таблица 2).

Таблица 2. Определение активности ферментов в сыворотке крови

Значения при гепатитах

Специфичность для гепатоцитов

Щелочная фосфатаза (ШФ)

31-115 Ед/л дети: до 350 Е/л

* значения приведены в соответствии с рекомендациями диагностических тест-систем, используемых в КДЛ НПФ «Литех»

Для дополнительного подтверждения гепатогенной природы ферментемии можно определить активность печеночноспецифических ферментов — сорбитдегидрогеназы, фруктозо-1-фосфатальдолазы, урокиназы и др. Они локализуются преимущественно в гепатоцитах и их выявление в крови однозначно связано с патологией печени. Вместе с тем, эти тесты уступают по чувствительности определению активности АЛТ. Активность АЛТ и АСТ отражает выраженность воспаления в печени, но не этиологию гепатита.

Белковые пробы

При острых вирусных гепатитах общее содержание белков плазмы крови и их состав практически не изменяются. Исключение представляет тимоловая проба, в норме имеющая значения до 4 ЕД и возрастающая до 6-8 ЕД при гепатитах.

При ХГ на стадии ЦП могут наблюдаться уменьшение концентрации альбумина в сыворотке крови, снижение протромбинового индекса (менее 70%), уменьшение концентрации других факторов свертывания крови в рамках синдрома печеночно-клеточной недостаточности. Дополнительными показателями активности гепатита являются ускорение СОЭ (і15 мм/ч), повышение концентрации гамма-глобулинов сыворотки.

Выявление серологических маркеров вирусных гепатитов

Установить вирусную природу гепатита и получить информацию об его этиологии возможно только путем выявления серологических маркеров вирусов гепатита. К таким маркерам относят вирусные белки (антигены), специфичные антитела, вырабатываемые организмом в ответ на инфекцию, и нуклеиновые кислоты вируса (ДНК или РНК), представляющие его геном.

Совокупность методов, позволяющих выявлять в биологических тканях и жидкостях специфические вирусные или бактериальные белки (антигены) или антитела, вырабатываемые в организме хозяина в присутствии того или иного возбудителя, относят к иммунологическим методам лабораторного анализа. За последние несколько десятилетий иммунологические методы исследования получили повсеместное распространение. Причиной этого явилось тесное слияние иммунологии и биотехнологии, которое позволило разработать и внедрить в практику широкий спектр тест-систем, основанных на взаимодействии антиген — антитело. Применительно к вирусным гепатитам, иммуноферментный анализ относится к непрямым методам обнаружения возбудителя, позволяющим установить этиологию болезни.

Сравнительно недавно в практику клинико-диагностических лабораторий вошли методы генодиагностики, позволяющие обнаруживать и характеризовать гены или несмысловые последовательности ДНК и/или РНК. Своим развитием эти методы обязаны разработкой в 1983 г принципа полимеразной цепной реакции (ПЦР). Первые сообщения по практическому применению ПЦР появились в 1985 г и с тех пор количество публикаций, где ПЦР используется в качестве одного из методов исследования, занимает одно из первых мест в мировой научной литературе. Эти подходы приложимы для обнаружения и исследования геномов инфекционных агентов, обнаружения маркеров онкологических заболеваний, выявления генетических изменений в геноме человека, связанных с теми или иными функциональными нарушениями. В отличие от ИФА, ПЦР-анализ относится к прямым методам обнаружения возбудителя в клиническом материале, что позволяет оценить активность вирусного процесса и проследить процессы распространения возбудителя в различных органах и тканях.

Серодиагностика вирусного гепатита В.

Вирус гепатита В (hepatitis B virus, HBV) относится к семейству Hepadnoviridae. Геном вируса представлен частично сдвоенной кольцевой молекулой ДНК размером 3200 п.н. При световой микроскопии HBV выглядит сферической частицей диаметром 42 нм (частица Дейна), состоящей из ядра — нуклеоида, имеющего форму икосаэдра диаметром 28 нм, внутри которого находится двуцепочечная ДНК, концевой белок и фермент ДНК-полимераза. В состав нуклеоидного белка входят HBcAg и HBeAg. Внешняя оболочка (толщиной 7 нм) образована поверхностным антигеном HBV — HBsAg (рис. 2, 3). Вирус гепатита В является псевдоретровирусом, т. е. его ДНК может частично встраиваться в геном гепатоцитов.

Ознакомьтесь так же:  Аргентинский напиток алкогольный

Рис. 2. Схема строения вириона HBV и компонентов поверхностного антигена. Избыточная продукция поверхностного белка (HBsAg) приводит к его нахождению в сыворотке крови больного в свободном виде.

Рис. 3. Частицы Дейна в сыворотке крови больного (световая микроскопия)

При ОВГ и обострении ХГ вирусные частицы можно обнаружить в гепатоцитах и сыворотке крови больного. При интегративной форме ХГ В и в стадии ремиссии HBV в сыворотке крови не выявляется.

Основой лабораторной диагностики инфекции HBV является определение серологических маркеров инфицирования вирусом: HBsAg, HВeAg, анти-НВс класса IgM и IgG, анти-НВе и анти-HBs, HBV ДНК и активности вирусной ДНК — полимеразы. В зависимости от течения вирусного гепатита В спектр изменения серологических маркеров выглядит по-разному (рис 4, 5)

Рис. 4. Спектр изменения серологических маркеров при остром гепатите В со стадией разрешения

Рис 5. Спектр изменения серологических маркеров при хронизации острого гепатита В

HBsAg — основной маркер инфицирования HBV. При остром вирусном В в большинстве случаев (90-80 %) HBsAg удается выявить в инкубационном периоде, начиная с 3-5-й недели заражения. Средняя продолжительность циркуляции антигена — 70-80 дней. Быстрое исчезновение HBsAg (в первые дни желтухи) с появлением антиНВs — плохой прогностический признак. При хроническом гепатите В HBsAg может циркулировать в крови больного на протяжении многих лет. Следует отметить, что применяющиеся в настоящее время методы определения HBsAg, в том числе ИФА, имеют порог чувствительности. Поэтому при наличии клинических признаков гепатита и отсутствиии HBsAg в сыворотке крови необходимо исследовать другие маркеры инфекции HBV. Наличие HBsAg в крови свидетельствует о присутствии вируса в печени и с большой долей вероятности в крови. Не всякая сыворотка, содержащая HВsAg, содержит вирус гепатита В. В ряде случаев ДНК вируса встраивается в ДНК гепатоцита не полностью, а частично, только тем участком, который кодирует синтез HBsAg. В этих случаях синтезируются HBsAg без других компонентов вириона, (то есть без других антигенов). Считают, что такая ситуация возникает при «здоровом» носительстве HBsAg.

HBeAg вируса гепатита В характеризует высокую инфекционность крови, являясь показателем активной репликации HBV. HBeAg циркулирует в крови больного только в присутствии HBsAg. В первую неделю желтушного периода он выявляется у 85-95 % больных. Выявление HBeAg в течение двух и более месяцев служит прогностическим признаком развития хронического гепатита. У большинства больных хроническим гепатитом с высокой активностью процесса HBeAg сохраняется на длительный срок (до нескольких лет).

Антитела к ядерному антигену вируса гепатита В класса M (анти-НВc IgM) — маркер активной репликации НВV и острой инфекции. Выявляются через 1-2 недели после обнаружения HBsAg и сохраняются на протяжении 2-18 месяцев. У 4-20 % больных острым гепатитом В анти-HBc IgM являются единственным маркером инфекции. При ХГ В анти-НВс IgM могут быть выявлены у некоторых больных в меньших титрах, чем при острой инфекции, причем титр антител отражает тяжесть гепатита.

Антитела к HBcAg класса G (анти-НВс IgG) появляются практически одновременно с анти-НВс IgM. Как првило, они остаются у всех лиц, переболевших гепатитом В, пожизненно. У 95 % носителей HBsAg наряду с HBsAg циркулируют и анти-НВс IgG.

Антитела к HBsAg (анти-НВs) свидетельствуют о ранее перенесенной инфекции или о наличии поствакцинального иммунитета (защитный уровень — 10 МЕ/мл). Они появляются в период выздоровления, через 4 недели после исчезновения HBsAg, достигая максимальной концентрации через 1-2 года, с последующим постепенным снижением уровня, недоступного выявлению современными методами диагностики. В некоторых случаях анти-HВs могут циркулировать пожизненно. Появление анти-HBs на фоне клинического улучшения у больного гепатитом В является хорошим прогностическим признаком. Важно отметить, что в динамике острой инфекции HBV имеется «окно», когда HBsAg уже не определяется, а анти-HBs еще не появились. При этом выявляются анти-HBc IgM и IgG. Из этого следует вывод о необходимости обследования больных ОВГ на анти-HBc IgM даже при отрицательных результатах исследования HBsAg и анти-НВs.

Антитела к HBeAg (анти-НВе) появляются в крови после элиминации HBeAg и завершения репликации вируса. К концу 9-й недели острого периода гепатита В более 90 % больных имеют анти-НВе. В период выздоровления анти-НВе могут исчезать. Однако, наличие анти-НВе не является показателем отсутствия инфекционности конкретной сыворотки крови. Показано, что у ряда больных в ходе развития гепатита В (около 10%) под влиянием «иммунного давления» на вирус возникают мутантные формы, которые «избегают» иммунного надзора и не элиминируются. У носителей анти-HBe был выделен мутант, неспособный продуцировать HBeAg из-за дефектов в области precore и получивший обозначение HBeAg-отрицательного. Появление HBeAg-отрицательного мутанта приводит к прогрессированию поражения печени при продолжающейся репликации вируса (наличие ДНК HBV в сыворотке крови). При первичном инфицировании HBeAg-отрицательным мутантом существенно возрастает риск развития фульминантного гепатита.

Описанные маркеры гепатита В исследуются методом ИФА. Спектр антител (анти-НВе, анти-НВs, анти-НВc IgM, анти-НВc IgG) и антигенов (HBsAg, HBeAg) позволяет установить диагноз гепатита В и определить стадию заболевания (таблица 3). Недостатком данного метода является невозможность его использования при заражении мутантными формами вируса, при иммуносупрессии (больные онкологическими заболеваниями, наркоманы и т.д.) и для количественной оценки присутствующего в организме возбудителя. Решение этих задач стало возможным в результате внедрения молекулярно-биологических методов в практику клинико-диагностических лабораторий.

Таблица 3. Различные сочетания серологических маркеров инфицирования вирусом гепатита В и их интерпретация

антиНВc
IgM

антиНВ
c сумм

Методы генодиагностики, к которым относится ПЦР, существенно расширяют возможности лабораторной диагностики вирусного В, позволяя непосредственно выявить возбудитель, установить тканевую и внутриклеточную локализацию HBV, выявить и охарактеризовать мутантные формы вируса, оценить уровень виремии в течение заболевания, в том числе — на фоне противовирусной терапии.

В настоящее время существует широкий спектр диагностических тест-систем для выявления ДНК HBV в лабораторных условиях, основанных на методах ПЦР — фирмы «Roche», НПФ «Литех», «ДНК технология», LCR (лигазная цепная реакция) — фирма «Abbott», bDNA (метод «развлетвленных» ДНК зондов) — фирма «Chiron». Эти тест-системы позволяют проводить качественное определение наличия возбудителя в биологическом материале: сыворотке или плазме крови, ткани печени, мононуклеарах. Одним из вариантов качественного определения ДНК HBV является технология ПЦР in situ (в гистологических срезах), позволяющая установить внутриклеточную локализацию вируса в гепатоцитах.

Единственная коммерческая тест-система дифференциальной диагностики НВеAg-отрицательного гепатита В создана фирмой «Abbot» с использованием LCR. Существенным недостатком этой системы является выявление только одной из многих мутаций, приводящих к отсутствию синтеза НВеAg вирусом. Выявление всей совокупности генетических изменений, характерных для НВеAg-отрицательных вирусов гепатита В, возможно пока только прямым секвенированием ПЦР-амплифицированных фрагментов вирусного генома.

Количественная характеристика содержания ДНК HBV в клинических образцах важна для оценки эффективности противовирусной терапии и имеет прогностическое значение для определения хронизации HBV. При исходно низком уровне виремии (ДНК HBV менее 500 фг/мкл) процент хронизации острого гепатита В близок к нулю, при концентрации HBV ДНК от 500 до 2000 фг/мкл хронизация процесса наблюдается у 25-30% больных, а при высоком уровне виремии у пациента (более 2000 фг/мкл) острый гепатит В чаще всего переходит в хронический.

Известные коммерческие тест-системы оценки концентрации ДНК HBV реализуют принцип конкурентного ПЦР-анализа с последующей гибридизационной схемой определения продуктов амплификации (фирма «Roche», НПФ «Литех»). Этот подход основан на внесении в клинический образец внутреннего стандарта известной концентрации, качественно отличающегося от определяемой матрицы. После ПЦР концентрация ДНК HBV в исследуемом материале рассчитывается на основании известной концентрации внутреннего стандарта и соотношения накопления продуктов амплификации внутреннего стандарта и определяемой матрицы.

В настоящий момент развитие методов лабораторной диагностики гепатита В идет по направлению создания коммерческих тест-систем для идентификации клинически значимых мутантных штаммов HBV, а также использованию новых оптических приборов (биосенсоров) для комплексной диагностики инфекции HBV (вирусных белков, антител к ним и ДНК HBV)

Серодиагностика гепатита С

Вирус гепатита С (hepatitis C virus, HCV) является РНК содержащим гепатотропным и лимфотропным вирусом, относящимся к семейству Flaviviridae. Геном вируса представлен одноцепочечной молекулой (+) РНК размером около 9500 оснований, кодирующей структурные и неструктурные белки (рис. 6).

Рис. 6. Схема геномной РНК НCV и синтеза вирусных белков

К структурным белкам относят белок сердцевины (кор) и гликопротеины оболочки (Е1 и Е2). Неструктурную область представляет комплекс белков с ферментативной активностью, в первую очередь РНК-зависимая — РНК полимераза. Помимо вирусных белков, снаружи вирион покрыт липидной оболочкой состоящей из липопротеинов организма хозяина низкой плотности (рис. 7).

Рис. 7. Схема строения вириона вируса гепатита С.

До 1990 г. ХГ ни-А-ни-В с парентеральным путем передачи диагностировали на основании повышенной активности АЛТ сыворотки в течение 6 месяцев, при отсутствии других известных маркеров вирусных гепатитов. Однако у части больных ХГ С уровень АЛТ не повышается. В современной диагностике гепатита С основная роль отводится определению антител к HCV и выявлению РНК HCV.

В отличие от гепатита В, при котором могут быть определены антигены вируса и антитела к ним, при гепатите С методом ИФА улавливаются только антитела. Антигены HCV, если и попадают в кровь, то в количествах, которые практически не улавливаются. Они могут быть обнаружены только в ткани печени при использовании иммунногистохимических методов исследования. Это существенно ограничивает возможность оценки течения и активности инфекционного процесса.

Анти-HCV не свидетельствуют о продолжающейся репликации вируса, и могут являться признаком как текущей, так и перенесенной инфекции. Приходится также учитывать, что у реципиентов, которым была перелита инфицированная кровь, могут обнаруживаться анти-HCV донора, не обязательно свидетельствующие о заражении HCV. У больных ХГ С анти-HCV обнаруживаются в крови не только в свободной форме, но и в составе циркулирующих иммунных комплексов.

Антитела образуются к каждому из вирусных белков, расположенных в структурной и неструктурной области вирусного генома. Этим определяется их различная специфичность и, соответственно, разная диагностическая информативность. Для скрининга гепатита С используют метод ИФА, а в качестве подтверждающего теста — метод иммунноблота (RIBA). Существует несколько поколений диагностических тест-систем для выявления анти-HCV, отличающихся своей чувствительностью и специфичностью (таблица 4).

Таблица 4. Сравнение разных поколений диагностических иммуноферментных тест-систем для выявления антител к ВГС.

*Тест-системы 4-го поколения содержат синтетические и рекомбинантные вирусные антигены, размеры которых могут отличаться от фрагментов 3-го поколения.

Первая диагностическая тест-система на основе определения антител к С-100-3 была разработана в 1989 году в лаборатории М. Houghton и быстро получила повсеместное распространение. Она позволяла улавливать антитела в зоне, характеризующей всего 12% вирусного белка в неструктурной области (NS3, NS4). Кроме того, искусственный рекомбинантный антиген С-100-3 не полностью совпадает с натуральными вирусными белками, что предопределяет его слабую иммунногенность. Антитела к С-протеину (кор Ag) с помощью антигена С-100-3 вообще не улавливаются. Это предопределило низкую специфичность определения анти-HCV и большое число ложноотрицательных результатов, особенно при ХГ С. У больных с выраженной гипергаммаглобулинемией наоборот, тест С-100-3 часто является ложноположительным.

Ознакомьтесь так же:  Как в домашних условиях лечиться от чесотки

Тест-системы 2-го поколения, возникшие в 1991 году, позволяют улавливать антитела к белкам в разных зонах генома не только неструктурной, но и структурной области. Их преимуществом явилась, прежде всего, высокая специфичность, а также возможность более полного представительства спектра антигенов HCV. Использование тест-систем 2-го поколения позволило существенно улучшить отбор доноров и уменьшить угрозу развития посттрансфузионного гепатита С.

При использовании тест-систем 2-го поколения также не исключены ложноотрицательные результаты, в частности, у больных с необычными для данного региона генотипами HCV. Наиболее совершенны тест-системы 3-го и 4-го поколения, использующиеся в клинической практике начиная с 1995 года.

Тест-системы 3-го и 4-го поколения позволяют выявить анти-HCV в 99,7% случаев. В некоторых случаях антитела к HCV могут не обнаруживаться, например, при запаздывании иммунного ответа, применении иммуносупрессивной терапии или иммуносупрессии на фоне онкологического заболевания, приема наркотических веществ и т.д. Очень редко наблюдаются ложноположительные результаты. Для их исключения сомнительные сыворотки анализируют в RIBA или INNO LIA тестах, которые выявляют антитела к каждому отдельному белку HCV. Установление диагноза гепатита С и наблюдения за больными часто бывают затруднены при использовании только классических методов лабораторной диагностики. Это связано с особенностями протекания инфекции HCV, в течение которой могут наблюдаться: бессимптомное течение начальных стадий заболевания; низкий, часто нормальный уровень АЛТ; позднее появление антител (до 2-х лет от начала заболевания); отсутствие надежной тест-системы для выявления вирусных белков. Генодиагностика гепатита С Ведущую позицию в лабораторной диагностике инфекции HCV занимают методы генодиагностики, позволяя: непосредственно выявить генетический материал вируса в сыворотке крови и тканях человеческого организма (мононуклеарах, гепатоцитах, ткани костного мозга и т.д.); оценить репликативную активность вируса в тканях; количественно определить концентрацию вируса в сыворотке крови; установить генотип вируса и вести наблюдение за изменчивостью HCV. Обнаружение в сыворотке крови РНК HCV является «золотым стандартом» диагностики, свидетельствующем о продолжающейся репликации HCV. По рекомендации ВОЗ установление диагноза гепатита С возможно на основании троекратного обнаружения HCV РНК в сыворотке крови больного при отсутствии других маркеров гепатита. В острую фазу гепатита РНК выявляется в крови уже через 1-2 недели после заражения, т.е. задолго до появления анти-HCV. При всей неоднородности популяции HCV, все генетические варианты вируса имеют консервативный участок в 5′-нетранслируемой области генома, на обнаружении, которого основаны большинство известных диагностических тест-систем для выявления РНК HCV. До недавнего времени самым чувствительным тестом при определении РНК HCV считался тест Amplicor HCV фирмы «Roche», позволяющий выявлять 700 копий РНК в 1 мл. С помощью нового набора Abbott LCx можно определять 200 копий РНК/мл. Менее чувствительным, но широко распространенным в настоящее время является тест bDNA Quantiplex (фирма «Chiron»). Отечественные тест-системы основаны на определении РНК HCV в клиническом образце методом RT-PCR c использованием в качестве мишени амплификации консервативной 5′ не транслируемой области вирусного генома (НПФ «Литех», ДНК-технология). Проведение ПЦР позволяет выявить РНК HCV не только в сыворотке крове, но и в ткани печени, что важно в подтверждении роли HCV в формировании гепатоцеллюлярной карциномы. У данной категории больных РНК HCV регистрируется в гепатоцитах и при отсутствии анти-HCV и HCV РНК в сыворотке крови. Отличительной особенностью течения инфекции HCV является развитие многочисленных внепеченочных проявлений, что требует наблюдения за распространением вируса в организме. Методом ПЦР РНК HCV определяется в мононуклеарах крови, криопреципитатах, ткани клеточного мозга, биопсии печени и мышечной ткани. Существует методологический подход, позволяющий не просто определять наличие вируса в ткани, но и оценивать его репликативную активность — реакция на (-) цепь РНК. При наблюдении за больными ХГ С существенную роль играют количественная оценка содержания вируса в сыворотке или плазме крови больного и определение генотипа HCV. Наиболее благоприятный ответ на противовирусное лечение наблюдается у лиц с низким уровнем виремии и генотипом 2 или 3. В основе известных диагностических тест-систем количественной оценки содержания HCV лежит подход, основанный на принципе конкурентной амплификации РНК HCV и внутреннего стандарта. В первую очередь это диагностикумы «Amplicor HCV monitor kit» фирмы «Roche» и «NASBA HCV» («Organon»). Количественные тест-системы фирмы «Chiron» bDNA Quantiplex, которые позволяют непосредственно оценить концентрацию матрицы в образце по интенсивности регистрируемого сигнала. Эти тест-системы отличаются надежностью, лучшей воспроизводимостью, но более низким уровнем чувствительности, по сравнению с амплификационными. Сотрудниками фирм Gen-Probe и Bayer Diagnostics опубликованы результаты количественного определения РНК HCV методом TMA (transcription-mediated amplification) с очень низким порогом чувствительности — 50 копий/мл. Большинство отечественных лабораторий для оценки концентрации РНК HCV используют метод предельных разведений. В основе его лежит раститровка анализируемой матрицы до исчезающих концентраций и вычисление исходной концентрации на основании результатов амплификации в сравнении с калибровочной кривой. К сожалению, этот метод не достаточно точен, так как не учитывает возможность подавления реакции амплификации в пробирке с исследуемым образцом. Тем не менее, метод достаточно прост в исполнении и до сих пор используется в ряде лабораторий для «внутреннего пользования» (in house). Существенной особенностью характеристики HCV является его генетическая неоднородность, соответствующая особенно быстрой замещаемости нуклеотидов. В результате образуется большое число разных генотипов и субтипов. По классификации Simmonds разграничивают 11 типов (генотипы 1-11), в свою очередь подразделяющихся на 70 подтипов (например, подтипы 1а, 1в, 1с) HCV. Особенно много субтипов HCV регистрируется в Африке и Юго-Восточной Азии. Это косвенно подтверждает существование HCV в этих регионах уже в течение нескольких столетий. Допускают, что в Европе и Северной Америке HCV появился позже, чему и соответствует существенно меньшее число субтипов. Для клинической практики достаточно разграничивать 5 субтипов HCV: 1a, 1b, 2a, 2b, 3a. Установлены географические различия в распространении разных генотипов. Так, в Японии, на Тайване, частично в Китае, регистрируются преимущественно генотипы 1b, 2a, 2b. Тип 1b даже называют «японским». В США преобладает 1a — «американский» генотип. В Европейских странах преобладает генотип HCV 1a, в Южной Европе заметно возрастает доля генотипа 1b. На территории Российской Федерации преобладающим генотипом является 1b, составляющий 80 % популяции вируса, далее с убывающей частотой — 3a, 1a, 2a . Обычным методологическим подходом для типирования HCV является обнаружение характерных генетических изменений (мутаций) в консервативных областях вирусного генома — 5′ нетранслируемой, Кор, NS5A областях. Типирование HCV представляет собой амплификацию консервативных областей вирусного генома и анализ специфичных нуклеотидных последовательностей методами: прямого секвенирования амплифицированных фрагментов последующей ПЦР с типоспецифичными праймерами RFLP (анализ амплифицированных фрагментов с помощью ферментов рестрикции) обратной гибридизации с типоспецифичными зондами (LiPA) SSCP (анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК) Для установления генотипа HCV создана коммерческая тест-система InnoLiPA HCV («Innogenetics»), в основе которой лежит принцип обратной гибридизации с типоспецифичными зондами (рис. 8). 1- 1а генотип 2- 1в генотип 3– 2а генотип 4– 1в + 3а генотип 5– 2в генотип 6– 1а + 2а генотип 7– отрицательный контроль амплификации Рис. 8. Установление генотипа вируса гепатита С с использованием тест-системы «InnoLiPA HCV» В ряде крупных диагностических центров типирование HCV проводят по оригинальным методикам, используя ПЦР с типоспецифичными праймерами, рестриктазный анализ фрагментов ДНК (RFLP), или конформационный анализ одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP). Так, в клинико-диагностической лаборатории НПФ «Литех» генотип вируса определяется методом ПЦР-SSCP (рис. 9) или аллель-специфичной амплификацией с соответствующими праймерами. Рис 9. Генотипирование HCV РНК методом SSCP анализа:1-5 генотип 1в 6 — 1а7 — 2а8 — 3а Установлено, что популяция HCV не однородна у каждого пациента. HCV циркулирует в организме человека в виде гетерогенной смеси близкородственных мутантных штаммов, принадлежащих к одному генотипу вируса, но имеющих генетические отличия в вариабельных областях вирусного генома. Генетически отличающиеся друг от друга варианты ВГС, циркулирующие в организме одного хозяина, получили название «квазивидов». Исключительной нестабильностью характеризуется регион Е2/NS1, содержащий всего 80 нуклеотидов и получивший название гипервариабельного региона (НVR1). Предполагают, что именно антитела к белкам, кодируемым участком генома Е2/NS1, обладают вируснейтрализующими свойствами. Исключительная нестабильностью HVR1 региона приводит к тому, что вирусу удается изменить свою антигенную структуру, в связи с чем иммунокомпетентные клетки не в состоянии распознать непрерывно обновляющиеся антигены. С наличием «квазивидов» связывают феномен ускользания вируса от иммунного ответа, неэффективное удаление HCV, и, как следствие, его длительное сохранение в организме человека и высокий процент хронизации инфекции. Оценку гетерогенности индивидуальной популяции HCV принято проводить на основании регистрации числа генетических вариантов HVR1 вирусного генома методами гетеродуплексного анализа или SSCP. По данным некоторых зарубежных исследователей, высокий уровень гетерогенности индивидуальной популяции HCV по HVR локусу обуславливает более тяжелое течение ХГ С с волнообразным характером колебания уровня тканевых трансаминаз и толерантностью к противовирусной терапии. Собственные исследования, проведенные на базе НИИ Физико-химической медицины показали, что регистрация генетических изменений популяции HCV при остром гепатите С не имеет прогностической значимости, как и в ряде случаев ХГ С. Таким образом, приходится рассматривать генетическую гетерогенность как адаптивную реакцию вируса, живущего в изменяющихся условиях организма хозяина, что подтверждается различиями в субпопуляциях HCV гепатоцитов, мононуклеаров и сыворотки крови человека. Кроме того, наблюдаемая в динамике генетическая изменчивость индивидуальной популяции HCV, наряду с изменением концентрации вируса в сыворотке крови больного, может служить косвенным маркером активности репликативного процесса, происходящего в клетках печени. Лабораторная диагностика гепатита С развивается по пути создания новых, более совершенных тест-систем. Ortho Clinic Diagnostic начала выпуск нового иммуноферментного набора для определения кор антигена в крови. Первым этапом является освобождение антигенов из клеточных структур путем лизирования сыворотки, вторым — улавливание антигенов с помощью специфических моноклональных антител. Данный тест особенно удобен при выявлении ранней стадии инфекции HCV, когда еще не появились вирус-специфические антитела. Фирмы Chiron и Gen-Probe предлагают новый амплификационный тест — NAT assay — для выявления РНК как HCV, так и HIV, способный улавливать единичные копии вируса в анализируемом материале. В заключении следует упомянуть о необходимости комплексного обследования больного с привлечением новейших достижений медицинской и биологической науки для правильной диагностики вирусных гепатитов и назначения адекватной терапии больному.

About the Author: admin