Репликации вируса гепатита

Особенности репликации вируса гепатита В.

Любые студенческие работы — ДОРОГО!

100 р бонус за первый заказ

Вирионы гепатита В (частицы Дейна) сферической формы с диаметром 42—45 нм. Они состоят из сердцевины диаметром 27 нм, содержащей вирусную двунитчатую кольцевую ДНК, окруженную мембраной толщиной 2 нм; сердцевина окружена внешней липопротеидной оболочкой толщиной 7 нм. Наряду с полноценными вирионами встречаются в гораздо большем количестве частицы, состоящие лишь из фрагментов наружной оболочки. Они могут быть сферическими с диаметром 16—25 нм и нитевидными с диаметром 10—20 нм и длиной до 700 нм. Нитевидные структуры являются агрегатами сферических частиц. Частицы содержат поверхностный антиген вируса — HBs-антиген и накапливаются в результате избыточной продукции поверхностного компонента частиц Дейна. Частицы HBs антигена не обладают инфекционной активностью, однако, они являются маркером на возможное присутствие частиц Дейна в исследуемом материале.

Гепатит В (гепабновирус) — подгруппа ДНК-содержащих вирусов, содержащих двунитевую ДНК.

Геном данного вируса представлен кольцевой молекулой ДНК, которая не является ковалентонозамкнутой молекулой ДНК, а имеется линкер, обеспечивающий закольцовывание. Причём одна из нитей имеет разрывы, т.е. несплошная, и стабилизация всей геномной молекулы обеспечивается второй нитью, которая не имеет разрывов. В составе вирусной частицы вируса гепатита В имеется фермент- ДНК-полимераза, которая обеспечивает достраивание разодранной нити до цельной нити и формирование двунитевой молекулы ДНК, которая транскрибируется с образованием РНК-продуктов двух типов:

  • РНК одного класса служит в качестве иРНК для синтеза соответствующих белков;
  • РНК второго класса представляет собой своеобразные РНК-матрицы для синтеза геномной ДНК вируса гепатита В. Причём этот синтез геномной ДНК вируса гепатита В на РНК-матрице осуществляется обратной транскриптазой (для чего – не известно).

(вирус гепатита В является предраковым – рак печени).

Геном вируса гепатита В не встраивается в генном клетки и в,, отличие от ретровирусов не проходит стадию интермедиата ДНК в процессе репродукции. Если обнаруживаются в геноме клетки фрагменты генома вируса гепатита В, то эта ситуация является инициирующей для процесса превращения клетки в злокачественную. С этим связана онкогенная функция гепатита В.

Схема репродукции вируса гепатита Б (гепабновирусы)

Родительская геномная ДНК вируса имеет разрывы в одной нити, вторая нить стабилизирует эти структуры. Полимеризующие ферменты вириона на первых этапах репродукции обеспечивают заделывание этих брешей(репарацию) и превращение в двунитевую структуру молекулы ДНК. Эта молекула транскрибируется и возникает 2 класса РНК:

Первый класс – это «+» иРНК транслируется в белки, среди которых обратная транскриптапза, полимераза, специфическая иРНК(?), которая участвует в репликации ДНК. РНК второго класса, возникающая при транскрипции ,является матрицей для синтеза с помощью обратной транскриптазы двунитевой геномной ДНК, включающаяся вместе со структурными белками в образование зрелого потомства. В природе существует генно-инженерная вакцина против гепатита В, созданная по технологиям рекомбинатных ДНК. Автор вакцины – сэр Кент Мурей.

Вирусный гепатит В. Определение формы и стадии заболевания

Комплексное исследование при подтвержденном вирусном гепатите В (HBV). Анализ маркеров инфекции позволяет установить клиническую стадию заболевания, иммунологический статус обследуемого, а также оценить эффективность лечения. Включает в себя определение белков вируса (антигенов), основных классов специфических антител, а также обнаружение ДНК вируса в крови.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

  • Исключить из рациона жирную пищу в течение 24 часов до исследования.
  • Не курить за 30 минут до сдачи крови.

Общая информация об исследовании

Вирусный гепатит B (HBV) – инфекционное заболевание, которое является причиной серьёзных поражений печени. Зачастую гепатит B переходит в хроническую форму, его течение становится затяжным и провоцирует возникновение цирроза и рака печени.

Вирус гепатита B (Hepadnaviridae) содержит двухцепочечную ДНК, окруженную нуклеокапсидом размером 27 нм, в состав которого входит антиген HBcAg, и внешней оболочкой, содержащей антиген HBsAg. Этот антиген обнаруживается в крови за 6 недель до появления симптомов заболевания и может выявляться длительное время как при их наличии, так и в при их отсутствии (при хроническом гепатите и носительстве). На ранних стадиях заболевания присутствует у 90-95 % больных.

Особенностью вируса гепатита B является то, что он поступает непосредственно в кровь и циркулирует в ней на протяжении всего периода заболевания. У некоторых пациентов вирус в крови сохраняется всю жизнь. По этой причине источником заражения могут стать не только те, кто болен гепатитом в его острой форме, но также те, кто уже перенес данное заболевание, а также люди, у которых заболевание не проявляется, однако они являются носителями вируса.

Полное выздоровление регистрируется у 92-95 % больных острым гепатитом В, и лишь у 5-8 % из них отмечается переход заболевания в хроническую форму.

Гепатит B лечится исключительно в условиях стационара. Это заболевание в случае длительного течения является фактором риска развития первичной гепатоцеллюлярной карциномы (рак печени).

В жизнедеятельности вируса гепатита В различают две фазы: фазу репликации и фазу интеграции. В фазе репликации происходит воспроизведение (размножение) вируса. ДНК вируса проникает в ядро гепатоцита, где с помощью ДНК-полимеразы синтезируется нуклеокапсид, содержащий ДНК вируса, антигены HBcAg, HBeAg, которые являются основной мишенью иммунной системы. Затем нуклеокапсид мигрирует из ядра в цитоплазму, где реплицируются белки внешней оболочки (HBsAg), и, таким образом, происходит сборка полного вириона. При этом избыток HBsAg, не использованный для сборки вируса, через межклеточное пространство попадает в кровь. Полная сборка (репликация) вируса заканчивается презентацией его растворимого нуклеокапсидного антигена – HBeAg на мембране гепатоцита, где происходит его «узнавание» иммуноцитами. Антиген HBcAg серологическими методами не определяется, потому что отсутствует в крови в свободном виде. Определяется наличие в крови антител (anti-HBc) к этому антигену, вырабатывающихся вследствие его высокой иммуногенности.

Маркерами фазы репликации вируса гепатита В являются:

  • выявление в крови антигенов HBeAg и anti-HBc (Ig M).

У 7-12 % больных хроническим вирусным гепатитом В возможен спонтанный переход фазы репликации в нерепликативную фазу (при этом из крови исчезает HBeAg и появляются anti-HBe). Именно фаза репликации обусловливает тяжесть поражения печени и контагиозность больного.

В фазе интеграции происходит интегрирование (встраивание) фрагмента вируса гепатита В, несущего ген HBsAg, в геном (ДНК) гепатоцита с последующим образованием преимущественно HBsAg. При этом репликация вируса прекращается, однако генетический аппарат гепатоцита продолжает синтезировать HBsAg в большом количестве.

Вирусная ДНК может быть интегрирована не только в гепатоциты, но и в клетки поджелудочной железы, слюнных желез, лейкоциты, сперматозоиды, клетки почек.

Фаза интеграции сопровождается становлением клинико-морфологической ремиссии. В этой фазе в большинстве случаев формируется состояние иммунологической толерантности к вирусу, что приводит к купированию активности процесса и носительству HBsAg. Интеграция делает вирус недосягаемым для иммунного контроля.

Серологические маркеры фазы интеграции:

  • наличие в крови только HBsAg или в сочетании с anti-HBc (IgG);
  • отсутствие в крови ДНК-вируса;
  • сероконверсия HBeAg в anti-HBe (т.е. исчезновение из крови HBeAg и появление anti-HBe).

Пациенты, перенесшие инфекцию и имеющие антитела к вирусу, не могут повторно заразиться гепатитом B. В некоторых случаях полное выздоровление не наступает и человек становится хроническим вирусоносителем. Вирусоносительство может протекать бессимптомно, но в некоторых случаях развивается хронический активный гепатит B. Ключевым фактором риска активного вирусоносительства является возраст, когда человек был заражен: для грудных детей уровень риска превышает 50 %, в то время как для взрослых остается на уровне 5-10 %. Исследования показывают, что мужчины чаще становятся носителями, чем женщины.

HBsAg – поверхностный антиген вируса гепатита В

Поверхностный антиген вируса гепатита В (HВsAg) является белком, который присутствует на поверхности вируса. Обнаруживается в крови при остром и хроническом гепатите В. Самый ранний маркер. Достигает максимума к 4-6-й неделе заболевания. Сохраняется до 6 месяцев при остром гепатите, свыше 6 месяцев – при переходе заболевания в хроническую форму.

HBeAg – ядерный ‘е’-антиген вируса гепатита В

Антиген, находящийся в ядре вируса. Появляется в крови одновременно с HBsAg и сохраняется в течение 3-6 недель. HBeAg появляется в крови больного острым гепатитом В одновременно с HBsAg или вслед за ним и сохраняется в крови 3-6 недель. Указывает на активное размножение и высокий риск передачи вируса при половом контакте, а также перинатально. Инфекционность HBeAg-положительной сыворотки в 3-5 раз выше, чем HBsAg-положительной. Выявление HBeAg в крови более 8-10 недель свидетельствует о переходе заболевания в хроническую форму. При отсутствии репликативной активности вируса во время хронической инфекции HBeAg не выявляется. Его появление же свидетельствует о реактивации вируса, что чаще происходит на фоне иммуносупрессии.

Ознакомьтесь так же:  Консультация для родителей о прививках против гриппа

При лечении вирусного гепатита В исчезновение HBeAg и появление антител к HBe-антигену свидетельствует об эффективности терапии.

anti-HBc (Ig M) – специфические антитела класса IgМ к ядерному ‘core‘ антигену вируса

Начинают вырабатываться еще до клинических проявлений, указывают на активную репликацию вируса.

Появляются в крови через 3-5 недель, сохраняются в течение 2-5 месяцев и исчезают в период выздоровления.

anti-HBc – суммарные антитела (IgM+IgG) к ядерному ‘core’ антигену вируса гепатита В

Важный диагностический маркер, особенно при отрицательном значении HBsAg. Антитела класса IgM вырабатываются через 3-5 недель. Антитела класса IgG начинают вырабатываться с 4-6-го месяца и могут сохраняться пожизненно. Подтверждают контакт организма с вирусом.

anti-HBs – суммарные антитела к поверхностному антигену вируса гепатита В

Появляются медленно, достигая максимума через 6-12 месяцев. Указывают на перенесенную инфекцию или наличие поствакцинальных антител. Выявление этих антител свидетельствует о выздоровлении и развитии иммунитета. Обнаружение антител в высоком титре в первые недели заболевания может быть связано с развитием гипериммунного варианта фульминантного гепатита В.

anti-HBe – антитела к ‘е’-антигену вируса гепатита В

Появляются на 8-16-й неделе после инфицирования у 90 % больных. Свидетельствуют о завершении острого периода болезни и начале периода реконвалесценции. Могут сохраняться до 5 лет после перенесенного заболевания.

HBV (ДНК) – ДНК вируса гепатита В

Маркер наличия и репликации вируса. Методом ПЦР можно определить ДНК вируса качественно или количественно. Благодаря качественному методу подтверждается присутствие вируса гепатита В в организме и его активное размножение. Это особенно важно в сложных диагностических случаях. При инфицировании мутантными штаммами вируса результаты теста на специфические антигены HBsAg и HBeAg могут быть отрицательными, но при этом риск распространения вируса и развития заболевания у зараженного человека сохраняется.

Качественное определение ДНК вируса играет важную роль в раннем выявлении гепатита В у людей с высоким риском инфицирования. Генетический материал вируса обнаруживается в крови на несколько недель раньше, чем HBsAg. Положительный результат ПЦР за период более 6 месяцев указывает на хроническую инфекцию. Определение вирусной нагрузки (количество ДНК вируса в крови) позволяет оценить вероятность перехода заболевания в хроническую форму.

Повышенные уровни печеночных трансаминаз при положительном результате ПЦР являются показателями необходимости проведения терапии. Во время лечения вирусного гепатита В исчезновение ДНК вируса свидетельствует об эффективности лечения.

Для чего используется исследование?

  • Для оценки серологического профиля;
  • для выяснения стадии заболевания и степени контагиозности;
  • для подтверждения заболевания и уточнения его формы (острая, хроническая, носительство);
  • для наблюдения за течением хронического гепатита В;
  • для оценки эффективности противовирусной терапии.

Когда назначается исследование?

  • При выявлении у пациента поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg);
  • при подозрении на инфицирование вирусом гепатита В и сомнительных результатах серологических тестов;
  • при микст-гепатитах (сочетанные вирусные гепатиты В и С);
  • при динамическом наблюдении за больным гепатитом В (определение стадии процесса при совместном исследовании на другие специфические маркеры инфекции).

Что означают результаты?

Для каждого показателя, входящего в состав комплекса:

Острый гепатит В. Выделяют «дикий» штамм (естественный) и «мутантный» штамм (вид) вируса. Определение штамма вируса имеет определенное значение при выборе противовирусного лечения. Мутантные штаммы вируса несколько хуже поддаются лечению в сравнении с «диким».

Хронический гепатит В (ХВГВ). Выделяют три серологических варианта:

  1. ХВГВ с минимальной активностью (ранее использовали термин «носительство HBsAg»);
  2. НВе-негативный ХВГВ;
  3. НВе-позитивный ХВГВ.

Интерпретация сочетаний серологических маркеров гепатита В

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему: Репликация HCV в патоморфогенезе хронического гепатита С (ультраструктурное, иммуногистохимическое и ПЦР-исследование)

Оглавление диссертации Караваева, Юлия Юрьевна :: 2006 :: Новосибирск

Глава I. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ВИРУСА ГЕПАТИТА С

1.1. Молекулярная биология вируса гепатита С

1.2. Методы идентификации вируса гепатита С

1.3. Современные концепции пато- и морфогенеза хронической HCV-инфекции.

Глава II. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИХ

НАБЛЮДЕНИЙ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Общая характеристика клинических наблюдений

2.2. Методы клинико-биохимического и серологического исследования.

2.3. Метод полимеразной цепной реакции.

2.4. Методы патоморфологического изучения биоптатов печени

2.5. Методы статистического анализа результатов.

Глава III. ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БИОПТАТОВ ПЕЧЕНИ ПАЦИЕНТОВ

С ХРОНИЧЕСКОЙ НСУ-ИНФЕКЦИЕЙ

3.1. Светооптическое исследование биоптатов печени.

3.2. Электронно-микроскопическое исследование.

3.3. Иммуногистохимическое исследование.

Глава IV. КЛИНИКО-БИОХИМИЧЕСКОЕ И СЕРОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ НСУ-ИНФЕКЦИЕЙ.

4.1. Клинико-биохимическое обследование пациентов.

4.2. Результаты серологического исследования.

Глава V. РЕПЛИКАЦИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА С

И СТЕПЕНЬ АКТИВНОСТИ ХРОНИЧЕСКОЙ НСУ-ИНФЕКЦИИ

5.1. Определение степени активности хронического гепатита С.

5.2. ПЦР-исследование репликации вируса гепатита С и сопоставление со степенью активности хронической HCV-инфекции

Введение диссертации по теме «Патологическая анатомия», Караваева, Юлия Юрьевна, автореферат

Актуальность темы. Вирус гепатита С (HCV), принадлежащий к семейству флавивирусов, — один из наиболее часто встречающихся инфекционных агентов, обусловливающих патологические изменения печени. Клинически поражение печени может варьировать от легкой формы хронического гепатита до цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы (Шерлок Ш., Дули Д., 1999; Ивашкин В.Т., 2002; Майер П., 2004; Ferreira-Gonzalez А., Shiftman M.L., 2004). В отличие от других гепатотропных вирусов человека, HCV в большинстве случаев вызывает хронический процесс с умеренным размножением вируса, что, как правило, характеризует HCV-инфек-цию как персистирующую (Толоконская Н.П., 1999; Непомнящих Г.И. и др., 2001; Pham T.N. et al., 2004).

Взаимодействие между вирусом гепатита С и иммунной системой инфицированного находится в фокусе активного изучения. HCV является РНК-вирусом с высоким уровнем генетической вариабельности, поэтому вирус может ускользать от иммунного ответа макроорганизма посредством продолжающихся мутаций (Colina R. et al., 1999; Kim Y.J. et al., 2005). Другой характеристикой HCV-инфекции является не только неадекватность гуморального и клеточного иммунного ответа, но и нередкое развитие аутоиммунного феномена (Ordi-Ros J. et al., 2000). Таким образом, пер-систенция HCV связана с развитием спектра иммунопатологических реакций, варьирующих от «безопасной» продукции органонеспецифических антител до лимфопролиферативных процессов, таких как смешанная кри-оглобулинемия II типа и неходжкинские лимфомы (Lauer G.M., Walker B.D., 2001).

HCV реплицируется не только в гепатоцитах, но и в мононуклеарных клетках периферической крови, клетках костного мозга и других органов, даже центральной нервной системы (Laskus Т. et al., 2000; Forton D.M. et al., 2004; Castillo I. et al., 2005; Goncalves P.L. et al., 2005). Лимфотропизм HCV указывает на прямое взаимодействие специфических протеинов вируса, в частности, core, с регуляторными механизмами и функциями лим-фоидных клеток (Schuttler C.G. et al., 2004; Tillmann H.L. et al., 2005). Результатом таких взаимодействий может быть модификация иммунного ответа против антигенов HCV и возникновение патологических реакций против аутоантигенов. Молекулярные процессы, лежащие в основе взаимодействия HCV и лимфоидных клеток, являются недостаточно изученными; предполагается, что в мононуклеарных клетках крови вирус индуцирует экспрессию Fas на поверхности клеток, что запускает процесс клеточной гибели путем апоптоза (Brown P.M.J., Neuman M.G., 2001). Получены также свидетельства того, что апоптоз инфицированных гепатоцитов опосредован экспрессией Fas (Pianko S. et al., 2001).

Патогенез хронической HCV-инфекции остается недостаточно изученным. Рассматриваются два важнейших механизма в развитии инфекционного процесса: один из них — прямое цитопатическое действие вируса, другой представляет собой комплекс иммунных ответов, направленных против инфицированных гепатоцитов, содержащих чужеродные протеины HCV (Di Bisceglie A.M. et al., 1993; Kato N. et al., 1993). При попытке внести ясность в решение этой проблемы некоторые исследователи анализировали взаимоотношения между количеством вируса (виремии) в сыворотке крови или в ткани печени и характером ее патологических изменений (Idrovo V. et al., 1996; Chang M. et al., 2000; Benkoel L. et al., 2004).

Остается спорным вопрос, действительно ли виремия отражает количество вируса в печени, так как методы, используемые для количественного определения уровня РНК в печени, основаны на первичной экстракции из общей РНК гепатоцитов, количественное содержание вируса в гепато-цитах (точнее, число инфицированных гепатоцитов) — на чувствительности и специфичности метода. При использовании гибридизации in situ (Rodriguez-Inigo E. et al., 1999) установлено, что уровень виремии имеет отношение к числу инфицированных гепатоцитов у HCV-инфицированных пациентов с хроническим активным процессом — виремия коррелировала с процентом HCV-инфицированных гепатоцитов. Вероятно, оба варианта патогенеза хронической HCV-инфекции могут сосуществовать одновременно, и одним из возможных путей изучения является оценка корреляции между уровнем вирусной нагрузки и степенью повреждения печени (Haydon G.H. et al., 1998; Altiparmak E. et al., 2001).

Цель исследования — изучить роль репликации вируса гепатита С в патоморфогенезе хронической HCV-инфекции по данным клинико-биохимического, патоморфологического и ПЦР-исследования.

Ознакомьтесь так же:  Ребенок заболел ветрянкой что делать

1. Изучить репликацию вируса гепатита С при хроническом гепатите С — наличие репликации в образцах крови и ткани печени, уровень виремии, генотип HCV.

2. Провести светооптическое, электронно-микроскопическое и им-муногистохимическое исследование биоптатов печени при хронической HCV-инфекции.

3. Сопоставить данные по репликации вируса гепатита С с результатами клинико-биохимического и патоморфологического исследования.

Научная новизна. Впервые проведено исследование маркеров репликации вируса гепатита С в различных биологических субстратах (по данным ПЦР с РНК HCV), количества инфицированных гепатоцитов (по данным иммунодетекции NS3-антигена HCV в биоптатах печени), уровня виремии и генотипа HCV в сопоставлении со степенью активности хронической HCV-инфекции.

Впервые показано, что наличие РНК вируса гепатита С в крови и/или ткани печени (по данным ПЦР) и число инфицированных гепатоцитов (по экспрессии NS3Ag при иммуногистохимическом исследовании) не имеют достоверной связи со степенью активности инфекционного процесса, оцениваемой по клинико-биохимическим тестам и структурным изменениям печени.

Установлено, что при достаточно высоком уровне виремии (от 10б до 108 копий HCV в 1 мл плазмы) доминировали минимальные изменения структуры печени: в 60% случаев выявлена слабо выраженная степень активности HCV-инфекции (r=0,631, р < 0,001).

Независимо от генотипа HCV доминировала слабо выраженная степень активности инфекционного процесса (в том числе при генотипе lb — в 70% случаев). Отсутствие зависимости между репликацией HCV и степенью поражения печени при хронической HCV-инфекции обусловлено выраженной антивирусной реакцией гепатоцитов, фенотипически проявляющейся клеточно-инволютивной дистрофией.

Практическая значимость. Полученные в работе данные могут быть использованы в клинической практике для решения вопросов диагностики, терапии и прогноза хронических вирусных гепатитов. Проведенное исследование свидетельствует о важности и необходимости патоморфологиче-ского изучения биоптатов печени. Отсутствие зависимости между репликацией HCV и степенью активности патологического процесса в печени требует критического пересмотра алгоритмов диагностики и лечения хронического гепатита С, ориентированных на результаты ПНР как на основной диагностический и прогностический фактор заболевания, и подчеркивает необходимость биопсии печени для адекватной диагностики и оценки динамики патологического процесса.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 12 — 14-й научно-практических конференциях врачей «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 2002 — 2004), на областной научно-практической конференции «Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине» (Новосибирск, 2002), на городских научно-практических конференциях «Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике» (Новосибирск, 2002, 2003), на VI Российском съезде врачей-инфекционистов (С-Пб., 2003), на 9-й Российской конференции «Гепатология сегодня» (М., 2004), на юбилейной научно-практической конференции «Инфекционные болезни на современном этапе: Достижения, проблемы, перспективы» (Новосибирск, 2004), на международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Новосибирск, 2004), на Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Новосибирск, 2005), на ученом совете ГУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2006).

Публикации. По теме кандидатской диссертации опубликованы 22 научные работы:

1. Караваева Ю.Ю., Шестенко О.П. Результаты ПЦР-исследований на вирусные гепатиты в различных биологических субстратах (опыт ПЦР-лаборатории МИКБ № 1) // Актуальные вопросы современной медицины: Тезисы докл. 12-й науч.-практ. конф. врачей. — Новосибирск, 2002. — С. 362.

2. Караваева Ю.Ю., Шестенко О.П. Опыт использования отечественных ПЦР-тест-систем в лабораторной практике // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике: Сборник статей городской науч.-практ. конф. — Новосибирск, 2002. — Вып. 2. — С. 44 — 52.

3. Непомнящих Г.И., Толоконская Н.П., Айдагулова С.В., Непомнящих Д.Л., Сахарова Е.Г., Мезенцева Г.А., Караваева Ю.Ю. Морфогенез хронического гепатита С: Патоморфологическое, молекулярно-биологиче-ское и иммуногистохимическое исследование биоптатов печени // Сиб. журн. гастроэнтерол. и гепатол. — 2002. — № 14 — 15. — С. 7 — 9.

4. Непомнящих Г.И., Айдагулова С.В., Непомнящих Д.Л., Толоконская Н.П., Караваева Ю.Ю. и др. Иммуногистохимическое, молекулярнобиологическое и патоморфологическое исследование биоптатов печени при хроническом гепатите С // Бюл. экспер. биол. — 2002. — Т. 134, № 9. -С. 356-360.

5. Nepomnyashchikh G.I., Aidagulova S.V., Nepomnyashchikh D.L., То-lokonskaya N.P., Karavaeva Yu.Yu. et al. Immunohistochemical, molecular and pathomorphological study of liver biopsy specimens during chronic hepatitis С // Bull. Exper. Biol. Med. — N. Y.: Plenum Publ. Corp., 2002. — Vol. 134, № 3. -P. 307-311.

6. Непомнящих Г.И., Айдагулова C.B., Караваева Ю.Ю. и др. Биомолекулярные маркеры хронической HCV-инфекции // Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине: Материалы областной науч.-практ. конф. — Новосибирск, 2002. — С. 37 — 38.

7. Караваева Ю.Ю., Айдагулова С.В., Батемирова Е.В. Оценка реп-ликативной активности вируса гепатита С в различных биологических субстратах у больных хроническим вирусным гепатитом // Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине: Материалы областной науч.-практ. конф. — Новосибирск, 2002. — С. 113-114.

8. Мезенцева Г.А., Айдагулова С.В., Караваева Ю.Ю., Батемирова Е.В. Морфологические маркеры токсического поражения печени у наркозависимых пациентов с хронической HCV-инфекцией // Бюл. СО РАМН. -2003.-№ 1.-С. 28-31.

9. Непомнящих Г.И., Толоконская Н.П., Айдагулова С.В., Непомнящих Д.Л., Караваева Ю.Ю. и др. Является ли репликация вируса гепатита С маркером степени активности инфекционного процесса ? (по данным полимеразной цепной реакции и морфологического анализа биопсий печени) // Бюл. экспер. биол. — 2003. — Т. 135, № 3. — С. 343 — 348.

10. Nepomnyashchikh G.I., Tolokonskaya N.P., Aidagulova S.V., Nepomnyashchikh D.L., Karavaeva Yu.Yu. et al. Is replication of hepatitis С virus a marker of activity of infectious process? (Findings of polymerase chain reaction and morphological analysis of liver biopsy specimens) // Bull. Exper. Biol. Med. — N.-Y., 2003. — Vol. 135, N 3. — P. 296 — 300.

П.Гончарова И.А., Курышева Н.Г., Красильникова И.В., Караваева Ю.Ю. и др. Активность хитотриозидазы сыворотки крови у больных вирусным гепатитом С на фоне наркотической зависимости // Актуальные вопросы современной медицины: Тезисы докл. тринадцатой науч.-практ. конф. врачей. — Новосибирск, 2003. — С. 341.

12. Непомнящих Г.И., Толоконская Н.П., Караваева Ю.Ю. и др. Им-муногистохимическое, молекулярно-биологическое и патоморфологиче-ское исследование биоптатов печени при хроническом гепатите С // Актуальные вопросы современной медицины: Тезисы докл. тринадцатой науч.-практ. конф. врачей. — Новосибирск, 2003. — С. 351.

13. Караваева Ю.Ю., Шмакова М.В., Красильникова И.В. и др. Значение ПЦР в диагностике парентеральных гепатитов // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике: Сборник статей городской науч.-практ. конф. — Новосибирск, 2003. — Вып. 4. — С. 174-181.

14. Караваева Ю.Ю., Непомнящих Г.И., Сахарова Е.Г. и др. Сопоставление уровня виремии, генотипа вируса и степени активности по биопсиям печени у больных с хронической HCV-инфекцией // Материалы VI Российского съезда врачей-инфекционистов. — С-Пб., 2003. — С. 163.

15. Непомнящих Г.И., Айдагулова С.В., Непомнящих Д.Л., Караваева Ю.Ю. Биопсия печени в диагностике и прогнозе хронической HCV- и HBV-инфекции // Рос. журн. гастроэнтерол. — Приложение № 22. Материалы 9-й Рос. конф. «Гепатология сегодня». — М., 2004. — С. 19, № 62.

16. Караваева Ю.Ю., Мельникова О.В. Значение методов ИФА и ПЦР в диагностике репликативной активности вируса при хронической HBV-инфекции // Тезисы докл. юбилейной науч.-практ. конф. врачей «Инфекционные болезни на современном этапе: Достижения, проблемы, перспективы». — Новосибирск, 2004. — С. 49 — 50.

17. Караваева Ю.Ю., Непомнящих Г.И., Толоконская Н.П. и др. Им-муногистохимическое, молекулярно-биологическое и патоморфологиче-ское исследование биоптатов печени у больных хроническим гепатитом С // Тезисы докл. юбилейной науч.-практ. конф. врачей «Инфекционные болезни на современном этапе: Достижения, проблемы, перспективы». — Новосибирск, 2004. — С. 51 — 52.

18. Непомнящих Г.И., Толоконская Н.П., Айдагулова С.В., Непомнящих Д.Л., Караваева Ю.Ю., Мезенцева Г.А. HCV-инфекция: Репликация вируса и активность инфекционного процесса // Международная конференция «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний». — Новосибирск, 2004. — С. 173.

19. Томиленко Т.Г., Мельникова О.В., Караваева Ю.Ю. и др. Оценка значимости специфических маркеров в диагностике хронической HCV-инфекции // Актуальные вопросы современной медицины: Тезисы докл. четырнадцатой науч.-практ. конф. врачей. — Новосибирск, 2004. — С. XI-12.

20. Караваева Ю.Ю., Мельникова О.В. Оценка репликативной активности вируса при хронической HBV-инфекции методами ИФА и ПЦР // Генодиагностика инфекционных болезней: Материалы Российской науч.-практ. конф. — Новосибирск, 2005. — С. 48 — 50.

21. Караваева Ю.Ю., Сахарова Е.Г., Красильникова И.В. и др. Диагностический мониторинг при проведении комбинированной противовирусной терапии хронического гепатита С // Генодиагностика инфекционных болезней: Материалы Российской науч.-практ. конф. — Новосибирск, 2005. -С. 51-53.

22. Пышный Д.В., Пышная.И.А., Зарытова В.Ф., Иванова Е.М., Караваева Ю.Ю. и др. Генодиагностика вируса гепатита С методом обратной гибридизации // Генодиагностика инфекционных болезней: Материалы Российской науч.-практ. конф. — Новосибирск, 2005. — С. 60 — 64.

Заключение диссертационного исследования на тему «Репликация HCV в патоморфогенезе хронического гепатита С (ультраструктурное, иммуногистохимическое и ПЦР-исследование)»

1. Наличие РНК вируса гепатита С в крови и/или ткани печени по данным полимеразной цепной реакции и число инфицированных гепатоцитов (по экспрессии NS3Ag при иммуногистохимическом исследовании) не имеют достоверной связи со степенью активности инфекционного процесса, оцениваемой по клинико-биохимическим тестам и патоморфологи-ческому исследованию биоптатов печени.

Ознакомьтесь так же:  Таблетки от гриппа на букву к

2. При сравнительно высоком уровне виремии (от 10 до 10 копий HCV в 1 мл плазмы крови — предел тест-системы) доминируют минимальные изменения структуры печени: в 60% случаев выявлена слабо выраженная степень активности HCV-инфекции (r=0,631, р < 0,001).

3. При позитивной иммунодетекции NS3Ag HCV в биоптатах печени установлена слабо выраженная (53% случаев) и минимальная (18% случаев) степень активности хронического гепатита С при различном количестве экспрессирующих NS3Ag гепатоцитов. Количество инфицированных гепатоцитов не коррелировало со степенью активности инфекционно-вирусного процесса.

4. При генотипировании HCV в 53% случаев выявлен генотип lb, в 30% случаев — генотип 2, в 14% — генотип За. Сопоставление генотипа HCV с уровнем виремии и степенью активности инфекционного процесса не выявило корреляционной связи. При генотипе lb в 80% случаев установлена слабо выраженная (70% случаев) и минимальная (10% случаев) степень активности инфекционного процесса.

5. При тестировании пяти биологических субстратов РНК HCV выявлена преимущественно в ткани печени — 79% случаев, в сыворотке крови -77% и мононуклеарных клетках крови — 73%; одновременно и в сыворотке, и в мононуклеарах — в 55% наблюдений, при этом в 18% случаев РНК HCV обнаружена в клеточных элементах и отсутствовала в сыворотке крови. РНК HCV выявлена в образцах слюны у 7 человек, в моче — у 5, у 3 пациентов — в обоих субстратах.

6. Наличие РНК HCV в нативной ткани печени сопровождалось им-муногистохимическим выявлением NS3-aHrareHa, т.е. иммунодетекция NS3 в гепатоцитах может рассматриваться как структурный маркер репликации вируса гепатита С. В большинстве случаев выявление антител к NS3 в сыворотке крови сочеталось с экспрессией NS3-aHrareHa в гепатоцитах. Интенсивная (выраженная и умеренная) иммуногистохимическая реакция с NS3-aHTHreHOM HCV в биоптатах печени в большинстве случаев сочеталась с нормальными показателями аминотрансфераз.

7. Анализ сопоставления серологических маркеров репликации вируса гепатита С по данным ПЦР и степени активности инфекционно-вирусного процесса по биоптатам печени показал, что при наличии РНК HCV в сыворотке и/или мононуклеарных клетках крови в 71% случаев в биоптатах обнаружена минимальная (16%) и слабо выраженная (55%) степень активности процесса. При отрицательной реакции на РНК HCV также преобладали минимальные патологические изменения в ткани печени. Статистический анализ не выявил корреляционной связи между наличием репликации вируса в крови и проявлениями структурных изменений в ткани печени.

8. Отсутствие зависимости между репликацией HCV и степенью поражения печени при хронической HCV-инфекции обусловлено выраженной антивирусной реакцией гепатоцитов, фенотипически проявляющейся клеточно-инволютивной дистрофией.

Инфицирование вирусом гепатита С (HCV) считается одной из ведущих причин заболеваемости и смертности во всем мире, вызывая широкий спектр поражений печени от бессимптомного носительства до терминальной стадии заболевания (Ивашкин В.Т., Буеверов А.О., 2002; Никитин И.Г., 2002). Наиболее важными особенностями HCV являются высокий уровень репликации, широкое генетическое разнообразие и изменчивость, которые обеспечивают уклонение от иммунного контроля, высокий процент хронизацин HCV-инфекции и распространенность феномена перси-стенции вируса. Встречаемость иммунологических маркеров HCV-инфекции у различных групп населения в разных странах колеблется от 1 до 10% (Львов Д.К., Дерябин П.Г., 1997). В США антитела к HCV обнаружены у 1,8% населения, у 75% из них выявлена виремия, и 2,7 миллионов человек имеют признаки активной HCV-инфекции (Lauer G.M., Walker B.D., 2001).

В Российской Федерации частота обнаружения антител к антигенам HCV в сыворотке крови доноров составляет 2 — 4% (Львов Д.К. и др., 1997). В настоящее время интенсивно изучаются свойства вируса гепатита С и особенности реакций организма инфицированного, создающие несостоятельность иммунного ответа и способствующие персистенции вируса и хронизации процесса (Bertoletti A., Maini М.К., 2000).

Нами было обращено внимание на то, что минимальная и слабо выраженная степень активности HCV-инфекции, определяемая по клиническим, биохимическим и патоморфологическим тестам, нередко сочетается с фазой репликации HCV. В связи с этим мы поставили своей задачей найти объяснение этому феномену путем тщательного анализа клинических, биохимических и патоморфологических данных и их сопоставления с ПЦР-исследованием.

Итак, при патоморфологическом исследовании биоптатов печени пациентов с хронической HCV-инфекцией обнаружены следующие закономерности. Для паренхиматозного компартмента характерны поражения дистрофического характера. Наиболее часто обнаруживали гепатоциты в состоянии жировой инфильтрации разной степени выраженности: от мелковезикулярных липидных включений, выявляемых лишь на полутонких срезах, до замещения всей цитоплазмы огромной липидной каплей, вызывающей деформацию и дислокацию ядра. Отмечено, что для гепатита С характерны мелковезикулярные липидные включения, располагающиеся преимущественно субплазмолеммально.

Вторым по частоте патологическим феноменом, характеризующим состояние паренхиматозных клеток, была клеточно-инволютивная дистрофия. Эти гепатоциты светооптически отличались своеобразным «опустошением» цитоплазмы, резким снижением содержания гликогена и гипо-хромностью ядер, располагались группами, иногда образуя округлые поля, занимающие территорию нескольких долек, или большинства фрагментов долек биоптата. В единичных случаях в биоптатах выявляли паренхиматозные клетки с признаками ацидофильной дегенерации, гомогенной резко эозинофильной цитоплазмой и пикнотичными ядрами. Как правило, эти гепатоциты локализовались перипортально.

Ультраструктурный анализ гепатоцитов выявил их значительную гетерогенность. Доминировали клетки с признаками клеточно-инволютив-ной дистрофии — феномен «опустошенности» связан с редукцией цито-плазматических органелл. Выявлялась динамика дистрофического процесса от фокальной редукции внутриклеточных органелл до почти тотальной «опустошенности». Процесс дегенерации сопровождается формированием гетерогенных резидуальных телец, иногда очень многочисленных, локализующихся в различных участках цитоплазмы, нередко мигрирующих к васкулярному полюсу гепатоцита и обнаруживаемых в пространстве Диссе. В гепатоцитах с «опустошенной» цитоплазмой сохранялось ядро и пе-ринуклеарные скопления элементов гранулярной цитоплазматической сети, свободных рибосом, полисом и мелких митохондрий.

В большинстве биоптатов наблюдали заметное расширение и деформацию портальных трактов за счет клеточной инфильтрации и склероза, обычно с сохранением четких паренхиматозно-стромальных границ. Состав инфильтрата представлен лимфоцитами, макрофагами, а также фиб-робластами различной степени зрелости, количественное соотношение которых определяется преобладанием фиброза или инфильтрации в портальном тракте.

Также в большинстве биоптатов обнаружена гиперплазия лимфоид-ной ткани портальной стромы в виде формирования округлых фолликуло-подобных образований, в некоторых образцах выявлены крупные лимфо-идные фолликулы с герминативными центрами — один из ведущих морфологических маркеров HCV-инфекции, а также признаки лимфодиапедеза, в результате которого появлялись внутрисинусоидальные и интергепатоцел-люлярные цепочки лимфоцитов и внутридольковые лимфоидные инфильтраты. Некробиотические очаги в паренхиме обнаруживали крайне редко, лишь при высокой степени активности HCV-инфекции, иногда выявляли внутридольковые постнекротические гранулемы.

Фиброзные изменения касались прежде всего портальной стромы. Однако в половине случаев (преимущественно у наркозависимых пациентов) наблюдали формирование прогностически неблагоприятного очагового или диффузного перисинусоидального склероза, а также склероз центральных вен с перивенулярным фиброзом. В большинстве случаев фиброзные изменения при хроническом гепатите С выражены слабо.

При вирусных поражениях печени ведущую роль в морфо- и цитоге-незе инфекционного процесса играет отношение субпопуляций альтерированных и регенерирующих гепатоцитов (Непомнящих Д.Л., 1994, 1998). Кроме описанных ранее структурных изменений печени (Серов В.В., Се-вергина Л.О., 1996; Непомнящих Г.И. и др., 1999; Серов В.В., 1999), показано, что при хроническом гепатите С преобладает особая форма повреждения гепатоцитов, характеризующаяся редукцией цитоплазматических органелл и визуальной картиной «опустошенности» клеток, что и подтверждено в данном исследовании.

Основу данной формы дистрофии составляет не альтерация и последующий некроз гепатоцитов, а снижение процессов восстановления «изношенных» цитоплазматических органелл за счет угнетения синтеза структурных белков — синдром регенераторно-пластической недостаточности (Непомнящих Г.И. и др., 1992). Этот вид дистрофии гепатоцитов имеет инволютивный морфологический фенотип, но, учитывая сохранение ядера и очагов внутриклеточной регенерации, можно считать это состояние клетки обратимым. Это можно интерпретировать и как защитную реакцию клетки в условиях вирусной инфекции.

По результатам комплексного исследования хронического гепатита С Г.И. Непомнящих и соавт. (1999, 2002) сформулирована концепция антивирусной стратегии популяции паренхиматозных клеток печени, включающая снижение биосинтетических реакций гепатоцита и в связи с этим подавление репликации вируса, а также фокальную деградацию цитоплаз-матического компартмента и экзоцитоз с элиминацией вирусных частиц (цитосанация) с последующим восстановлением структуры гепатоцитов за счет внутриклеточной регенерации. Распространенность такого вида клеточных изменений свидетельствует о важной роли клеточно-инволютив-ной дистрофии в морфогенезе и прогнозе болезни.

При сопоставлении данных ПЦР по определению РНК HCV и степени активности процесса по биопсиям печени при хронической HCV-инфекции обнаружено, что наличие репликации вируса не имеет достоверной связи со степенью активности инфекционного процесса. В основе этого феномена лежит главным образом выраженная антивирусная реакция паренхиматозных клеток печени, нивелирующая способность HCV к интенсивной репликации, гетерогенности и изменчивости, которые обусловливают несостоятельность иммунного ответа.

About the Author: admin